【摘要】目的：探讨兔骨髓间充质干细胞体外分离、培养和鉴定，观察其生物学特性。方法：采集兔股骨、胫骨、肱骨骨髓组织，采用密度梯度离心法和细胞贴壁培养法净化和提纯骨髓间充质干细胞，通过体外培养、分离和扩增，倒置相差显微镜观察细胞形态，流式细胞术检测细胞表面标记物，观察细胞生物学特性。结果：兔骨髓间充质干细胞形态呈梭形、纺锤形，旋涡状生长排列，增值活跃。细胞表面标记物CD44分子阳性，CD34分子阴性。结论：成功建立了兔BMSCs体外培养、分离和扩增的试验方法，从而证明骨髓间充质干细胞是理想的组织工程种子细胞。
【关键词】骨髓间充质干细胞；细胞培养；细胞鉴定
【中图分类号】R392.4【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0346-02
骨髓间充质干细胞(bone marrow-drived mes-enchymal stem cells,BMSCs是来源于骨髓的 MSCs，具有采集方便的优点，是理想的组织工程种子细胞［1］具有多向分化和自我复制潜能,易于自体采集、无免疫排斥反应、避免伦理学限制等优点,在细胞治疗方面得到了广泛的应用。但是BMSCs在骨髓微环境中所占比例极少,使用何种简单操作方法快速获取形态均一和纯度较高的BMSCs便成为该研究领域关注的焦点［2］。本实验采用全骨髓贴壁细胞培养法和密度梯度离心法相结合分离、纯化BMSCs，通过体外培养扩增，以及流式细胞术鉴定，建立稳定的BMSCs培养扩增方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物：日本大耳白兔4只，4周龄，雌雄不限，体重250~300g，购于兰州生物制品研究所。
1.2 主要试剂及仪器：二氧化碳培养箱(BB16UV型,德国Heraeus公司)、超净工作台(VS-1300L型,苏净集团苏州安泰空气技术有限责任公司)、倒置相差显微镜、超声波清洗仪、纯净水系统、酸度计、台式高速离心机(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)、低糖培养基(GBICO公司)、胎牛血清（杭州四季青）、谷氨酰胺、青链霉素、胰酶、流式细胞抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。
1.3 兔BMSCs的采集： 取4周龄日本大耳白兔一只，雌雄不限，20ml空针空气栓子经耳缘静脉注入，待兔死亡后，将其全部浸泡于75%酒精溶液内8~10分钟，在无菌环境下切开前后肢皮肤，切下兔前后两肢，剃去覆盖于肱骨、胫骨及股骨上的肌肉组织，注意保留骨的完整性，用组织剪分离股骨、胫骨及肱骨，将其置于无菌培养皿中，纵向依次剪开各长骨两端，5ml注射器沿剪开的骨端注入L-DMEM冲洗3次，收集冲洗液约10ml，用筛网过滤冲洗液，加入完全低糖培养基重悬组织冲洗液，吸管反复吹打混匀，1000 r/ min ，4 ℃，离心 5 min ，弃去上清。再次加入适量完全低糖培养基，吹打混匀，分别加入一次性培养皿中，放入37℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养（图1）。
1.4 兔 BMSCs 培养：1.4.1 原代 BMSCs 培养 向分离得到的细胞组织悬液加入 10ml 含 20 %胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的 L-DMEM 培养基重悬细胞，并转移至中号塑料培养皿内。将培养皿置于37 ℃，体积分数为 5 %的 CO2孵箱中培养。培养 72 h后使用含 20 %FBS 的 L-DMEM 完全培养基换液。原代培养 5-7 天后，细胞融合可达 80 %以上。将原代培养的 BMSCs 在倒置相差显微镜下观察细胞集落的形成和细胞形态（图2）。
1.4.2 传代 BMSCs 培养 待原代细胞铺满培养瓶底后，用EDTA胰蛋白酶消化贴壁细胞，FBS 终止消化后将细胞悬液以 1:3 比例接种于新培养瓶中，加入含 10 %FBS 的 L-DMEM完全培养基 5ml 培养，每隔 2 天换液，约 3-4 天后细胞可铺满瓶底。将传代培养的 BMSCs 在倒置相差显微镜下观察细胞形态。以此方法，向后传至三代（图3、4）。
1.5 兔 BMSCs的鉴定
对干细胞的鉴定主要是建立在对细胞表面标记物的识别基础上，采用流式细胞仪特有的细胞分析技术，可在短时间内精确分析出细胞表型以及其所占有的比例，使用间接标记法标记 CD44、CD34。取第3 代 BMSCs 以 2.0×105/mL 重悬，PBS 洗涤细胞 3次，向细胞悬液中加入鼠抗兔CD44、CD34 （稀释 1:100） 为一抗，4 ℃保存 30 min，加入羊抗鼠含 FITC、PE 的二抗，4 ℃避光保存 30min。PBS 洗涤细胞 3 次后放入流式细胞仪中检测。记录数据（图5、6）。
2 讨论
BMSCs具有贴壁性、具有强大的增殖能力和多向分化潜能、具有免疫调节功能、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。
2.1更好地增加BMSCs的贴壁性： 在BMSCs培养中，细胞贴壁培养与传代成功与否是本实验的关键。其中存在很多问题，比如在细胞贴壁方面，用一次性塑料培养皿效果要优于可重复使用的玻璃培养瓶、培养皿。塑料培养皿内壁有一层鼠尾胶原，它可以更好地促使骨髓间充质干细胞贴壁。
2.2 培养基最佳的酸碱度： 培养基中加碳酸氢钠的目的，是为了在二氧化碳培养箱中平衡培养基中的PH值。对于GBICO的DMEM培养基，3.7g是对应二氧化碳培养箱的二氧化碳浓度设定在10%，而5%的则对应的是2g碳酸氢钠。暴露在空气中的培养液，因为大气中二氧化碳的浓度很低，液体中的二氧化碳会气体分压高于大气，因此会逐渐溢出，浓度逐渐降低，液体的PH值也逐渐升高，如果DMEM在空气中存放时间过长，它将有可能变成紫红色。一般新配置的颜色正常，在多次开盖，培养液接触空气的时间较长后，颜色会逐渐变成紫红色，笔者的做法是，配制培养液时加hepes，用小容量的分装瓶分装，及尽量减少培养液与空气的接触时间。配培养基时，将酸碱度调至6.9-7.0，过滤后酸碱度会适当增高。
2.3 传代的注意事项
2.3.1 EDTA-胰酶最佳消化时间：具笔者在试验中的观察，在BMSCs传代过程中，根据培养瓶、培养皿或培养板中贴壁细胞的覆盖率确定，当BMSCs贴壁达到80%-90%就可以传代了，用玻璃尖吸管滴入EDTA-胰酶4-7滴，在倒置相差显微镜下观察，当细胞70%由原来的纺锤状、梭形变化为椭圆形时为最佳时间，一般为1至2分钟。
2.3.2 加入EDTA-胰酶后的吹打时间与次数 ：加入EDTA-胰酶后，静置1分钟，在镜下观察细胞变椭圆或圆形，并有轻度漂浮时，用尖吸管轻轻吹打3-6次即可。
2.3.3 骨髓间充质干细胞特异性标志物： 虽然目前尚未发现骨髓间充质干细胞特异性标志物，Pittenger等认为CD29、CD44、CD105、CD166、SH2、SH3为间充质干细胞的重要标志物［3］。
综上所述，对 BMSCs 的形态学观察和表型分子鉴定实验均证实培养传代的 BMSCs 的生物学特性并未发生明显改变，说明本实验的分离培养扩增方法安全有效。本实验成功的建立了一系列分离、体外培养和扩增兔 BMSCs 的实验方法，为进一步组织工程研究奠定了实验基础。
参考文献
［1］ 兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性观察Progress in Modern Biomedicine Vol.10 NO.17 SEP.2010 3239-3243
［2］骨髓间充质干细胞的分离、培养及生物学特性 陈建梅姚荣伟 李勇 张馥敏 江苏医药2010年10月第36卷第19期2306-2308
［3］Pittenger MF,Mackay AM, Beck SC，et al.Mlutilineage potential ofhuman mesenchymal stem cells，Science 1999；284（5411）:143-147
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