摘要：通过对中原油田石油残留污染土壤的微生物修复实验研究，利用优化原位土著微生物菌群辅以物理和化学相结合的修复技术，进行了土壤中石油残留污染的室内模拟降解实验，实验结果显示，土壤中残留石油含量在13 420?0 mg/kg、10 220?0 mg/kg、8 660?0 mg/kg、时，经过56 d微生物的降解实验，土壤中石油含量降解可达62?67%～72?4%，为土壤石油残留污染的修复提供了技术方法和应用的可行性研究。
关键词：石油残留污染；土壤；微生物修复
experimental study of microbial remediation for oil contaminated soil in central plains
zhang sheng,chen li,li zheng-hong,zhang cui-yun,yin mi-ying,he ze,
sun zhen-hua,ma lin-na,ning zhuo,zhang fa-wang （the institute of hydrogeology and environmental geology,cags，shijiazhuang 050061，china）
abstract:the laboratory modeling experiments of the oil residue pollution degradation in soil were carried out,which used the optimistic techniques of in-situ microbial communities combining with the physical and chemistry methods and the experimental study of microbial remediation for oil residue pollution in zhongyuan oil field.the results showed that degradation rate could reach 62?27%-72?40% for oil contents of 13 420?0 mg/kg,10220.0 mg/kg and 8 660?0 mg/kg in polluted soil after 56 d microbial degradation,which provided us the technology and the feasibility study of the remediation of oil residue pollution in soil.
key words: oil residual contamination;soil;microbial remediation
我国中原地区由于石油资源的长期大量开采利用，产生了一些环境问题。尤其是落地原油的污染已影响土壤的质量安全,特别是开采早期行成的石油污染，在土壤中经长期的自然降解许多易挥发和易降解的组分均已降解，土壤中残留的难降解石油组分仍大量存在，且危害性更大，土壤石油污染的防治研究工作已受到人们的广泛重视。jorgensen的试验显示,经生物堆埋,石油污染的土壤中石油可降低71%［1］。微生物修复技术主要机理是石油烃直接参与了微生物的生化反应,通过代谢作用降解土壤中的污染物［2］。土壤微生物修复技术的开发与研究已受到国内外学者的广泛关注［3-16］。目前已知能降解石油中各种烃类的微生物共有约100余属200多种，它们分属于细菌、放线菌、霉菌、酵母以及藻类［16］。本文利用优化土著微生物菌群辅以物理和化学方法相结合的综合修复技术，对土壤中长期残留石油污染进行降解模拟实验，取得了一些效果。该方法具有处理方法简单、费用低、修复效果好、对环境影响小、无二次污染、可原位治理等优点。因此，本研究为该技术的应用提供了技术支撑，具有重要的实际意义。
1 实验材料和方法
1.1 实验材料
化学试剂： mgso.4·7h.2o、 nh.4no.3 、cacl.2、fecl.3、kh.2po.4、k.2hpo.4、kcl、（nh.4）.2so.4、 caco.3、nacl、可溶性淀粉、蔗糖、乳酸、盐酸、酵母膏、牛肉膏、乙酸钠、琼脂、液体石蜡、石油醚、三氯甲烷等均为分析纯。
其它实验材料：新鲜马铃薯、濮阳徐镇镇石油残留污染土样等等。
添加剂：牛粪晾干粉碎（过2 mm筛）在121℃灭菌30 min。
实验用土壤样品采自河南省濮阳徐镇镇一废弃采油井周围，该油井1996年废弃距今已有十多年。样品采集从井口附近表层油泥至井口北部2 m处，2 m处采集表层0～25 cm和50～60 cm的土样，表层土壤为褐色粉土土壤，可见有含石油团块。土壤下层为土黄色粉土土壤。表层土壤中含有少量2～5 mm的碎石，土壤湿容重为1?96 ～1?99 g/cm?3；土壤干容重为1?61～1?72 g/cm?3。自然含水量14?45%～24?14%；ph为8?27～8?9。井口附近表层油泥中残油含量在421 200～?64 800 mg/kg，井口北2 m外表层0～25 cm处残油含量在?8 320～27 400 mg/kg，混合平均后为13 420 mg/kg。下层50～?60 cm的土样残油含量在21?4 mg/kg。
实验用玻璃器皿：150 ml、250 ml具塞三角瓶，125 ml、1 000 ml磨口细口试剂瓶，各种不同类型的细菌培养试管、培养皿、橡胶塞等。
主要仪器：qzd-1型电磁振荡器、kq218超声波清洗器、生物恒温培养箱、高速离心机、高压蒸汽灭菌器、无菌实验室、生化培养箱、hz150l恒温摇床培养箱、奥林巴斯生物显微镜、752n紫外可见光栅分光光度计、电热干燥箱及各种化学分析用玻璃仪器。
1.2 测试方法
石油分析测试方法：为紫外分光光度法。
降解石油微生物细菌培养优选方法：土壤微生物细菌培养用《土壤微生物研究法》［17］，和参考文献［18］－［20］介绍的方法，细菌初步鉴定用《常见细菌系统鉴定手册》［21］中的?方法。
1.3 实验步骤
1.3.1 石油降解菌的分离与优选
自然界的物质循环微生物细菌的生化作用是非常重要的一环，碳的循环也不例外。许多细菌就是碳循环的主要驱动因子之一，机理就是在细菌的作用下，将碳氢化合物降解为co.2和h.2o的整个过程，也是自然界对石油污染的自净功能的生态效应，对土壤和地下水环境保护具有一定的实际意义。据此用细菌的选择性培养基和富集培养基，对中原油田濮阳徐镇镇一废弃采油井石油残留污染土壤的样品进行菌种、菌群的培养分离，选择优化出实验用降解土壤残油的菌种、菌群。本次实验选择优化出的细菌初步鉴定主要为：假单胞菌属、微球菌属、放线菌属、真菌类（毛霉、曲霉）等菌群。
1.3.2 土壤残油污染降解实验步骤
根据上述实验选出的降解残油污染的优势菌群，利用不同的培养基对所选出的各类菌群进行放大培养。各类菌群培养3～5 d后进行混合培养，继续培养5～7 d后作为相应的石油烃降解实验。进行模拟不同含量条件下土壤残油污染的微生物修复实验。实验装置为250 ml具塞三角瓶。
土壤残油污染微生物降解模拟实验，用若干（按实验设计的数量）250 ml具塞三角瓶，每个瓶中加入100 g风干过?2 mm筛含有不同残油含量的土壤样品。实验用土样考虑避免其它因素的影响,选用同一采样点的样品,只是采集60 cm以上不同深度含油量不同土样,进行了一定的配制。不同残油含量的土壤样品制备如下:1号样为采样点表层0～25 cm混合均匀后,测残油含量为13 420 mg/kg。2号样为1号样加入同一采样点下层50～60 cm的土样20%混合均匀后,经测试残油含量为10 220 mg/kg。3号样为1号样加入同一采样点下层50～60 cm的土样35%混合均匀后,经测试残油含量为8 660 mg/kg。每个样品均匀接入3 ml培养好的菌液，加入30 ml营养液，营养液按培养基成分比例调控氮、磷、钙、镁、硫、铁等营养元素，营养液均匀加入，调节试验土层含水量在25%左右。按30 ℃温度条件进行实验，一定的间隔时间取出约1 g左右样品，50 ℃～60 ℃烘干研碎，分析土壤中石油的降解去除的含量。在实验中每次取样时要将剩余的实验瓶塞打开一下约3～5 min并搅拌，以利于氧气进入，使实验过程中有足够的氧，并保持实验装置内土样有一定的含水量。在第1号实验样品中为增强细菌的作用利用牛粪晾干粉碎过筛灭菌后作为添加剂，添加量为1%。该添加剂有两个主要作用，一是牛粪中主要成分为未分解的木纤维素，可为改良土壤的膨松剂，另外是其它有机成分，可作为细菌容易利用的营养素来源，其它实验条件同其它。在一定时间取样测试石油含量的变化。
2 实验结果与讨论
不同土壤残油含量降解野外实验，是在2009年4月16日至6月12日进行。 考虑研究区地表土壤春、夏、秋温度一般在20 ℃～30 ℃左右，选择了30 ℃温度进行实验。实验结果见
从上述3个实验条件来看差异不是很大，仅有两点不同，一是1号样添加了1%的灭菌牛粪作为添加剂，二是石油残油量不同，其它实验条件一样。但是对石油残油的降解率还是有影响的，1号样添加了1%的灭菌牛粪作为添加剂，改良了土壤，另外它增加了细菌利用的营养来源加大了降解能力。其石油残油量不同，因加入的营养量是一样的则降解效果?不同。
实验结果显示,微生物细菌对土壤石油残油污染确有一定的降解作用。表1、表2显示,虽然实验选择了不同的残油含量的土壤进行，实验效果也有一定的差异。1号样残油含量最高，因其加入了1%的添加剂牛粪，从测试结果看虽然降解率是低了一点，但在相同其它条件下它的降解量是最大的，牛粪改良了土壤，增加了细菌利用的营养来源加大了降解能力。残油量在13 420 mg/kg经56 d降解率达62?67%。2号、3号样因其残油含量不同降解率有一定的差别，2号样残油量在10 220 mg/kg经56 d降解率达63?89%。3号样残油量在8 660 mg/kg经56 d降解率达72?40%。从2号、3号实验结果看，在相同实验条件下残油含量越低降解效果越好，其原因是微生物细菌在同等条件下所利用的营养资源量不同。从整个实验看土壤中因石油的长期残留污染，易降解的石油组分早已自然降解，残留的组分是较难降解的有一部分是很难降解的，如沥青等组分。本次实验结果同前期的降解实验结果对比也有很大的差异，前期实验是用的新鲜原油加入实验体系中，一般在相同条件30 d可使石油降解率达85%～95%以上。而本次实验是在56 d实验，时间延长了近一倍，残油的降解也只有62?67%～72?4%，也就是说石油污染土壤中的残油确实较难降解。但是，只要是将实验条件和微生物菌群优化选择好，其残油降解还是有较好的效果，从3组实验结果也得到了相互验证。
天然土壤中含有丰富的微生物,具有潜在的降解石油污染物的能力。且可降解石油的细菌在多年连续的污油中不断驯化,具有较强的降解石油污染物的潜力。采用投加从原来土著体系中筛选出的微生物进行生物强化，能克服其他外源菌所面临的存活力较弱、与土著微生物之间可能存在竞争关系等一系列问题，且这种生物强化技术操作简便，实用性强，在生物修复方面具有较广阔的应用前景。石油是由上千种化学性质不同的物质组成的复杂混合物，用单种微生物细菌很难将其彻底降解，目前在石油污染的生物处理上，越来越多的国内外学者采用细菌菌群进行生物处理 。如何能消除菌群种间的抑制作用，构建出优势混合菌群是目前菌群研究所要解决的一个问题，也是本实验研究的目的之一。本次实验通过对石油残油污染土壤微生物修复方法的模拟实验研究，利用优化原位土著微生物菌群辅以物理和化学方法相结合的修复技术，进行了实验温度、水、氧气、营养元素等的调控，对土壤中残油的降解实验，实验验证了微生物修复技术在土壤石油残油污染降解的有效性和应用的可行性。为野外原位试验提供了经验，奠定了基础，积累了技术。
3 结论
通过上述降解实验,微生物细菌对土壤石油残油污染的修复是有较好的降解作用。虽然实验样品土壤石油残油含量不同，实验效果还是有一定的差异。1号样利用牛粪晾干粉碎作为添加剂，增加了细菌的营养来源，增大了去除效果。2号、3号样在同等实验条件下残油含量低降解效果好，得到了相互验证的效果。从整个实验过程可得出土壤中石油残油含量在?13 420 mg/kg、10 220 mg/kg、8 660 mg/kg、时，经过56 d微生物降解实验，土壤中石油残油含量降解可达62?67%、63?89%、72?40%，为土壤石油残油污染的修复提供了技术方法和应用的可行性。验证了本次实验调控添加的营养元素和对土壤环境的改善是比较适度的，方法是可行的。具有处理方法简单、费用低、修复效果好、对环境影响小、无二次污染、可原位修复等优点。虽然是实验研究,用于野外大面积修复还有待完善,但通过不断努力是可以实现的，是具有较好的应用价值。
参考文献:
［1］ jorgensen k s,puustinen j,suortti a m.bioremediation of petroleum hydrocarbon contaminated soil by composting in biopiles［j］.environmental pollution,2000,107(2):245-254.
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［3］ sanjee mishra,jeevan jyot.in situ bioremediation potential of an oily sludge-degrading bacterial consortium［j］.current microbiology,2001,43 :328-335
［4］ josel r gallego,jorge loredo,juan f l lamas.bioremediation of diesel-contaminated soil:evaluation of potential in situ techniques by study of bacterial degradation［j］.biodegradation,2001,12 325-335 .
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