评价两种低温等离子体对粪肠球菌生物膜作用的体外实验研究

[摘要] 目的 比较辉光放电和介质阻挡放电两种低温等离子体装置产生的大气压低温等离子体对根管内粪肠球菌生物膜的杀菌效果。方法 在120颗离体牙的根管内部培养粪肠球菌生物膜，培养时间为7 d。将离体牙随机分为12个组，其中，10组分别接受介质阻挡放电和辉光放电这两种大气压低温等离子体装置处理离体牙根管，每种装置各处理5组，每组处理时间分别为2、4、6、8、10 min；另外2组为两种不同装置的单纯气体对照组。采用菌落形成单位计数法比较两种装置对根管内生物膜的杀菌效果，通过光谱测量仪分析两种装置的等离子体活性成分。结果 介质阻挡放电装置比辉光放电装置对根管内粪肠球菌生物膜的杀菌效果更好，不同时间段二者存活的细菌数量均有统计学差异（P

性物质成分一致，但激发态Ar原子的群峰总体上表现为介质阻挡放电装置是辉光放电装置的2倍。结论 介质阻挡放电装置产生的低温等离子体杀灭根管内粪肠球菌生物膜更具优势。

[关键词] 低温等离子体； 粪肠球菌； 生物膜； 根管； 杀菌

[中图分类号] R 780.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.020

细菌感染是顽固性根尖周炎和根管治疗失败最常见的因素，其中最常分离的菌株是粪肠球菌[1]。粪

肠球菌可以通过其分泌的蛋白酶（丝氨酸蛋白酶、白明胶酶、胶原结合蛋白）的作用来黏附在根管表面并进入牙本质小管内，从而更加耐受临床上常规的治疗手段[2]。氢氧化钙作为常规根管封药效果确定，但粪肠球菌在这种碱性药物环境中仍然可以顽强生存[3]。另外由于根管系统自身结构的复杂性，残存于侧支根管、副根管中的粪肠球菌难以被常规根管治疗中的机械和化学方法彻底清除。近年来，大气压低温等离子体在医学中的应用越来越广泛，如快速凝血[4]、基因转染[5]、牙齿美白[6]、杀菌[7]、诱导肿瘤细胞凋亡[8]等。研究显示其对于根管内的细菌感染也有确

定作用，但多局限于根管内游离菌或模拟根管内生物膜的研究[9-10]。对于不同发生装置的低温等离子体

根管杀菌效果少有研究。

大气压低温等离子体的发生装置及原理有4种，常用的为介质阻挡放电和辉光放电。介质阻挡放电是将绝缘介质插入放电空间的一种气体中放电，介质可以覆盖在电极上或悬挂在放电空间里，当在电极上施加足够高的交流电压时，即使在大气压下电极间的气体也会被击穿而产生放电。辉光放电是在两电极之间直接激发气体放电。辉光放电的电学特征为单脉冲，而介质阻挡放电则为大量细微的快脉冲放电通道所构成的放电。本研究使用这两种不同的装置，分别对离体牙根管内的粪肠球菌生物膜进行处理，观察其杀菌效果及与时间因素的关系，并对相关机制进行初步探索。

1 材料和方法

1.1 粪肠球菌的培养

粪肠球菌菌种（ATCC29212）保存于-80 ℃冰箱，使用接种环挑取菌液进行划线培养。36 h后挑取单克隆，于1 mL培养基中37 ℃静置24 h，使得细菌浓度达到每毫升1.0×107个菌落形成单位（colony forming

unit，CFU）。

1.2 离体牙预备

选取根尖发育完善、根面完整的单根管离体牙共120颗，自釉牙骨质界下截除牙冠部分，保证从根尖至断面的距离为10 mm。拔髓针拔除牙髓，15号锉通畅根管到解剖根尖孔，确定工作长度（自解剖

根尖孔至牙根断面的长度减去0.5 mm），使用15～40号手用镍钛锉（Mani公司，日本）按逐步后退法进行根管预备，预备过程中每更换1次器械均用5.25%次氯酸钠（NaClO）2 mL冲洗根管；预备结束后17%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）浸泡根管2 min，超声振荡；最后5.25%NaClO浸泡根管2 min，超声振荡。Clearfill AP-X光固化树脂（Ku-

raray公司，日本）封闭根尖孔。所有样本高温高压灭菌（121 ℃，20 min）后放入无菌生理盐水中4 ℃冰箱储存备用。

1.3 根管内粪肠球菌生物膜的培养

将预备好的牙根样本放入含有1 mL新鲜脑心浸液肉汤（brain heart infusion broth，BHI）培养基的EP管中，然后加入100 μL含有1.0×107 CFU·mL-1粪肠球菌的菌液，37 ℃厌氧培养，48 h换1 mL新鲜的培养基，共培养7 d。

1.4 大气压低温等离子体装置处理离体牙根管

将培养7 d的含有粪肠球菌生物膜的120颗离体牙样本随机分为12个组，每组10颗。其中，10组分别接受介质阻挡放电和辉光放电这两种大气压低温等离子体装置处理离体牙根管，每种装置各处理5组，每组处理时间分别为2、4、6、8、10 min；另外2组为两种不同装置的单纯气体对照组。

介质阻挡放电和辉光放电装置处理离体牙根管的方式见图1。图1左为介质阻挡放电装置的示意图，该装置包括一个特氟龙管以及在特氟龙管外面包绕的铜箔。该铜箔作为一个单电极，被连接到一个带有18 kV峰值电压、10 kHz正旋曲线的电源上。特氟龙管外径10 mm，内径7 mm，尖端出口处直径逐渐降到1.5 mm。使用流速为5 L·min-1的98%Ar和2%O2的混合气体通过特氟龙管。等离子体装置的功率为32 W，在特氟龙管尖端产生持续的等离子体，其暴露在空气中的长度为5 cm。在进行根管生物膜处理时，根管口距离等离子体发出口为5 mm，等离子体在根管口附近的温度为25～31 ℃。图1右为辉光放电装置示意图。该装置包含作为电极的两层铜管，这两个铜管由一层约0.5 mm厚的绝缘介质分开。等离子体射流端口的直径为0.6 mm。98%Ar和2%O2同样作为等离子体的发生气源，气体流速为5 L·min-1。该低温等离子体发生装置的维持电压为500 V，电流为30 mA，功率为15 W。等离子体射流从装置尖端发出的长度为5 mm，等离子体发射的端口距离根管口5 mm，温度为35～40 ℃。

1.5 两种装置对根管内生物膜杀菌效果的比较

大气压低温等离子体装置处理后，向离体牙根管中注入15 μL超纯水，插入光滑髓针搅拌1 min，取出光滑髓针，向根管中插入两个15号的无菌纸尖，将根管内的菌液吸出后将纸尖放入1 mL超纯水中。上述过程重复3遍，振荡1 min，取100 μL菌液进行10倍稀释涂板，37 ℃培养24 h。采用CFU计数法比较两种装置对根管内生物膜的杀菌效果[11]。

1.6 两种装置在平板上的杀菌范围的比较

挑取金黄色葡萄球菌（CGMCC1.2465）单菌落于20 mL溶菌肉汤培养基（Luria-Bertani，LB）中，振荡

器振荡，速度为180 r·min-1，培养18 h，取100 μL菌液放入20 mL新鲜培养基中振荡，速度为220 r·min-1，活化1.5 h，使细菌浓度为1.0×104 CFU·mL-1。分别取100 μL菌液涂布于20个LB培养板，然后使用两种装置处理，每种装置处理10个平板。装置等离子体发射口到培养板的距离为1 cm，活动范围为2 cm×2 cm，处理时间为1 min。过夜培养（37 ℃，12 h），观察金黄色葡萄球菌菌落生长情况。

1.7 光谱测量仪分析两种装置的等离子体活性成分

用多通道发射光谱测量仪（optical emission spec-troscopy，OES）（AvaSpec-2048-8-USB2型，Avantes公司，荷兰）标定低温等离子体中产生的活性成分。仪器的输出功率为24 W，工作温度为60 ℃。测量250～800 nm波长时活性物质的波峰。

1.8 统计分析

采用Origin 8.0软件进行统计分析，使用Games-Howell检验法进行多重比较。

2 结果

2.1 两种装置对根管内生物膜的杀菌效果

两种装置对根管内生物膜的杀菌效果见图2。统计分析表明，两种装置的单纯气体对照组均没有杀菌效果，含有的粪肠球菌均为1.0×107 CFU。两种不同等离子体装置处理粪肠球菌2、4、6、8、10 min后，各时间段二者存活的细菌数量均有统计学差异（P

2.2 两种装置在平板上的杀菌范围

在处理1 min后，两种装置的杀菌范围见图3。与辉光放电装置相比，介质阻挡放电装置对处理区域和未处理区域的杀菌效果都很明显，杀菌范围更广，穿透力更强。这与其对根管内生物膜的杀菌效果一致。

2.3 两种装置的等离子体活性成分

两种装置的等离子体活性成分光谱分析见图4。从图4可见，虽然两种装置的低温等离子体活性物质成分一致，激发态氧原子、羟自由基等活性成分的含量接近，但是激发态Ar原子的群峰总体上表现为介质阻挡放电装置是辉光放电装置的2倍。原子发射光谱大部分都是激发态的Ar，同时还检测到很多活性成分，如OH、O等。

3 讨论

粪肠球菌由于其生理特点[3]，在根管内形成生物

膜后具有更强抵御常用根管治疗药物的能力，所以常见于慢性顽固性根尖周炎和根管治疗失败的病例。如何消除复杂的根管系统内残余的粪肠球菌及其他微生物是临床上的难题。临床上根管治疗中广泛使用的根管冲洗液NaClO对粪肠球菌有一定的杀菌效果[12]。氯己定凝胶和冲洗液对粪肠球菌也有良好的

杀菌效果，但由于凝胶和液体流动性的限制，很难进入细小根管分支和牙本质小管[13]。氢氧化钙是常

用的根管封药材料，通过改变根管内pH值等物理环境来改变适应细菌生长的环境，但是单独使用对粪肠球菌生物膜无法达到高效的杀菌效果[14]。

低温等离子体的特点是高效杀菌，使用方便快捷，活性物质易扩散[15]，由于这种特点，将其应用

于复杂根管系统中时，气化的活性成分可以扩散到根管系统中不规则的末端结构，弥补了根管治疗传统方法的不足。

本研究建立了7 d粪肠球菌感染根管的模型，其能够形成结构致密的粪肠球菌生物膜，可以模拟临床上长期根管感染久治不愈的感染状态，这比以往研究中的体外模型更接近临床实际情况。通过使用两种不同低温等离子体装置对根管系统内的细菌进行梯度时间处理，发现生物膜随着处理时间的延长，粪肠球菌的数量逐渐降低，进一步对两种装置的杀菌效果进行量化比较，发现介质阻挡放电装置对根管内粪肠球菌生物膜具有更高效的杀菌效果。

本研究中还使用两种装置处理了根管外培养的金黄色葡萄球菌，目的是为了直观地反映不同等离子体的渗透作用和杀菌范围。结果显示介质阻挡放电装置比辉光放电装置具有更大的杀菌范围，渗透性更强。这一结果为两种装置对根管内粪肠球菌杀灭效果的差异提供了间接证据，等离子体的渗透性越好，在根管系统中的杀菌优势越明显。

光谱分析是对低温等离子体活性成分分析最常用的手段，本研究显示两种装置产生的低温等离子体的活性物质成分基本一致，活性氧、羟自由基等的含量相近，但介质阻挡放电装置使用的是交流电，激发电压及电压峰值较高，且功率要比辉光放电装置高1倍，能量更充足。在相同气体、相同流量的情况下，介质阻挡装置产生的电离化气体的带电粒子更充分，在可见的等离子体射流周围有更广泛的离子化气体和自由基的存在区。这表明，活性物质和电子都是低温等离子体装置不可或缺的杀菌因素。

低温等离子体由于其低温、高效、渗透性强、作用范围广等特点，在对根管内粪肠球菌生物膜的杀灭中具有传统方法无法比拟的优势，为根管消毒方法提供了全新的思路，其中介质阻挡放电装置产生的等离子体杀菌效果更好。等离子体中活性成分破坏生物膜的机制和对正常组织可能的影响还有待进一步的研究。

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